Desmistificando o monitoramento molecular baseado em PCR em LMC

 

   Quando o imatinibe, o primeiro inibidor da tirosina quinase (TKI), foi aprovado para o tratamento da leucemia mieloide crônica (LMC) em 2001, a história natural da doença e o tratamento foram transformados. Antes do interferon ser usado pela primeira vez como terapia para LMC na década de 1980, a sobrevida em longo prazo para aqueles com diagnóstico de LMC era rara, com menos de 15% dos pacientes sobrevivendo até 8 anos após o diagnóstico. Nas décadas de 1980 e 1990, com a introdução da combinação de interferon e quimioterapia, como a citarabina, a sobrevida em 5 anos aumentou para cerca de 50%. Desde 2001, após a aprovação do imatinibe, a taxa de sobrevida em 5 anos aumentou para 87%. 1 Pacientes em imatinibe que alcançam remissão molecular importante após 2 anos de terapia agora podem esperar viver tanto quanto seus colegas saudáveis. 

O imatinibe foi revolucionário, representando a primeira chamada “terapia direcionada molecularmente” para o câncer. Ao contrário de terapias menos direcionadas, o imatinibe se liga e bloqueia a atividade da tirosina quinase ABL1, que é responsável pela patogênese da LMC.

Tradicionalmente, as amostras de medula óssea dos pacientes eram usadas para realizar análises citogenéticas de metáfase, para identificar se o cromossomo Filadélfia estava presente e monitorar a resposta ao tratamento. Após o tratamento, se 20 ou mais metáfases não contiverem nenhum cromossomo Filadélfia, o paciente foi considerado como tendo uma resposta citogênica completa. Começando na década de 1990, um grande número de cromossomos poderia ser testado com sondas fluorescentes de hibridização in situ (FISH) para a fusão BCR-ABL1 , mas ainda assim apenas algumas centenas de células puderam ser analisadas.

Agora, com o advento dos ensaios moleculares baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR), "a resposta à terapia com TKI deve sempre ser monitorada pelo grau de resposta molecular, procurando a presença de níveis de RNA mensageiro BCR-ABL1 ", disse Michael Deininger, MD, PhD, professor e Chefe de Hematologia e Malignidades Hematológicas do Departamento de Medicina Interna da Universidade de Utah e do Huntsman Cancer Institute. “Este teste mais recente substituiu o teste citogenético para monitorar pacientes com LMC em terapia”. Isso ocorre em parte porque a terapia com TKI potente resulta em respostas profundas, e uma análise molecular é uma maneira muito mais sensível de detectar qualquer doença residual mensurável em comparação com um teste citogenético, explicou ele.

“No primeiro grande estudo com imatinibe, que comparou o TKI com a terapia com interferon, nosso laboratório e dois outros laboratórios realizaram a avaliação molecular do BCR-ABL1”, disse Jerald Radich, MD, especialista em genética molecular da leucemia no Fred Hutchinson Centro de Pesquisa do Câncer em Seattle. O teste foi então validado em outros laboratórios clínicos e se tornou a forma padrão de monitorar a LMC. ASH Clinical News falou com os drs. Deininger e Radich sobre o desenvolvimento de testes baseados em moléculas de PCR para monitorar pacientes com LMC, como é usado na LMC e como a tecnologia de teste está evoluindo.

O Advento do Monitoramento Molecular CML

Na década de 1980, Nora Heisterkamp, ​​PhD, agora professora do departamento de biologia de sistemas da City of Hope na Califórnia, e seus colegas do Instituto Nacional do Câncer dos EUA descobriram que o "cromossomo Filadélfia", que estava presente em quase todos os pacientes com LMC , foi o resultado da fusão de dois genes, BCR e ABL1 . Normalmente, esses dois genes estão localizados em cromossomos diferentes. 

Separadamente, Owen Witte, MD, professor da University of California, Los Angeles nos departamentos de imunologia, microbiologia e genética molecular, juntamente com colegas em várias instituições mostraram que a fusão da proteína BCR-ABL traduzida do cromossomo Filadélfia leva diretamente a CML. 

Como o nível de RNA mensageiro BCR-ABL1 se correlaciona com a proteína BCR-ABL1 e com a carga da doença, os pesquisadores desenvolveram posteriormente um ensaio molecular baseado em PCR para monitorar os níveis do mRNA BCR-ABL1 usando amostras de sangue periférico dos pacientes. O teste fornece uma maneira única de monitorar a presença da doença e quantificar a carga de doença do paciente.

O método atual para monitoramento molecular do mRNA de BCR-ABL1 é a transcriptase reversa quantitativa (qRT) -PCR. Normalmente, o ensaio quantitativo pode detectar apenas algumas cópias do mRNA de BCR-ABL1 em um pool de fundo de 100.000 transcrições de mRNA totais. 5 Isso é então normalizado para a expressão de um gene de referência.

Para realizar o qRT-PCR, o RNA total é extraído da amostra de sangue ou medula de um paciente. O molde de mRNA de fita simples é transcrito reversamente para gerar DNA complementar de fita dupla sintético (cDNA), seguido de coamplificação quantitativa em tempo real do cDNA BCR-ABL e um gene de cDNA de controle interno. Em ensaios moleculares quantitativos, as curvas padrão são construídas por diluições em série de quantidades conhecidas de plasmídeo clonado, uma molécula de DNA extracromossômica que pode se replicar independentemente do DNA cromossômico, que contém o DNA de fusão. Esses materiais fazem parte dos kits comerciais padrão agora amplamente usados ​​para realizar o ensaio. Os resultados geralmente ficam disponíveis em 4 a 10 dias.

“Há uma maneira de usar o DNA para detectar a fusão do gene BCR-ABL1 , mas porque o ponto de ruptura onde o gene BCR se funde ao ABL1 abrange alguns milhares de quilobases e difere de paciente para paciente, um teste baseado em PCR baseado nisso exigem a criação de primers exclusivos para o teste de PCR para cada paciente, e é por isso que esse método não pegou ”, explicou o Dr. Radich.

Quais kits estão disponíveis?

Existem atualmente três testes qRT-PCR aprovados pela FDA para detectar BCR-ABL:

• Kit QuantideX qPCR BCR-ABL IS da Asuragen
• Kit de PCR digital QDx da Bio-Rad
• Teste Xpert BCR-ABL Ultra da Cepheid

Cada teste usa uma metodologia diferente para quantificar as transcrições BCR-ABL. O kit QuantideX qPCR BCR-ABL IS pode ser usado na amostra de sangue total de um paciente.

O kit de PCR digital QDx emprega o chamado PCR “digital”, que oferece uma maneira de aumentar a relação sinal-ruído para transcrições de baixa abundância. No método RT-qPCR "analógico" padrão, os técnicos geram uma curva padrão absoluta usando uma amostra de RNA com quantidades conhecidas de BCR-ABL1 em ​​paralelo com uma amostra do paciente para extrapolar o valor anteriormente desconhecido das transcrições de BCR-ABL1 na amostra do paciente.

Com o teste de PCR digital, a amostra do paciente é dividida em milhares de gotículas de nanolitros que são amplificadas em pequenos poços individuais ou em “bolhas” emulsionadas, dependendo da plataforma, resultando em uma eficiência de reação mais alta do que o teste de PCR padrão. Cada poço ou gota contém de maneira ideal uma única molécula modelo. Se houver amplificação, ela é lida como “positiva” e atribuída a um código digital 1; se não houver amplificação, é considerado negativo e recebe pontuação zero. Como essa pontuação digital permite a determinação da quantidade absoluta de moléculas, a geração de uma curva padrão é desnecessária. Este método produz dezenas de milhares de pontos de dados de uma única amostra e, de acordo com um estudo, aumenta o limite de detecção do mRNA BCR-ABL1 em ​​mais de 1 log, em comparação com qRT-PCR convencional.6

O terceiro teste, Xpert BCR-ABL Ultra, usa um sistema de cartucho automatizado que inclui todos os ingredientes necessários para quantificar as transcrições na amostra de sangue de um paciente. Esse teste molecular de PCR “automatizado” tem a vantagem de exigir menos etapas de um técnico, fornecendo resultados com mais eficiência e rapidez e minimizando o espaço para erros. 7

“[O ensaio molecular baseado em PCR] substituiu o teste citogenético para monitorar pacientes com LMC em terapia.”

—Michael Deininger, MD, PhD

“Essas três tecnologias fornecem, essencialmente, os mesmos limites de detecção”, disse o Dr. Radich. “O PCR digital de gotículas pode ser um pouco mais sensível, mas essencialmente todos fornecem uma maneira de valores de transcrição BCR-ABL quantitativos em um intervalo de 4 ou 5 log.”

“À medida que os pacientes alcançam respostas profundas, a questão é se o monitoramento de alta sensibilidade seria capaz de identificar pacientes com respostas particularmente profundas em comparação com aqueles com respostas não tão boas que podem continuar a ter CML ativa”, disse o Dr. Deininger.

O Dr. Radich também destacou outro método de teste de CML em desenvolvimento: o uso de manchas de sangue seco que podem ser enviadas para um laboratório centralizado e podem ser usadas em clínicas localizadas em áreas de recursos limitados. Este método usa menos sangue e, portanto, não pode ser tão sensível quanto os métodos convencionais, mas pode ser armazenado e enviado ao longo de algumas semanas.

Teste, padronizado

De acordo com a National Comprehensive Cancer Network e as diretrizes European LeukemiaNet para CML, o teste RT-qPCR é recomendado para confirmar um diagnóstico. 8,9 Então, depois que um paciente começa a terapia com TKI - seja com imatinibe ou com um dos inibidores de TKI BCR-ABL de próxima geração (dasatinibe, nilotinibe, bosutinibe ou ponatinibe) - as diretrizes sugerem monitorar os níveis de transcrição BCR- ABL usando RT -qPCR a cada 3 meses.

“Os valores em 3 meses, 6 meses e 12 meses demonstraram ser preditivos de resultados subsequentes, o que nos ajuda a categorizar o risco dos pacientes de falha subsequente da terapia”, explicou o Dr. Deininger.

RT-qPCR é recomendado a cada 3 meses até que as transcrições de BCR-ABL1 sejam inferiores a 0,1%, então a cada 3 a 6 meses.

Os pacientes são categorizados de acordo com o risco de recidiva ou progressão da doença: pacientes com “resposta ótima” que podem continuar com o mesmo tratamento; aqueles que, após os testes de acompanhamento, precisam mudar imediatamente sua terapia; e “casos de advertência” que estão em risco e devem ser monitorados de perto para entender o melhor momento para potencialmente mudar sua terapia.

No estudo International Randomized Study of Interferon versus STI571 (IRIS), os pacientes tratados com imatinibe tiveram pelo menos uma redução de 3 log nos níveis de transcrição de BCR-ABL1 em comparação com a linha de base padronizada, que se traduziu em um risco insignificante de progressão da doença ao longo de 12 período de um mês. 10 Com base nesses resultados, uma resposta molecular principal (MMR) é agora definida como uma redução de 3-log ou um nível de transcrição BCR-ABL1 de 0,1%. Os pesquisadores da CML liderados por Timothy Hughes, MD, da University of Adelaide e do South Australian Health and Medical Institute desenvolveram a escala internacional (IS), um sistema de monitoramento molecular que padroniza os resultados de RT-qPCR em laboratórios em todo o mundo usando um dos três genes de controle (BCR, ABL1 ou GUSB ). O IS tornou-se o padrão ouro para expressar os valores de PCR dos pacientes.

“A vantagem da escala internacional é que cada laboratório pode usar seu próprio ensaio e, em seguida, pode usar um fator de normalização para calcular o valor de transcrição BCR-ABL em uma escala relativa”, disse o Dr. Deininger. “Dessa forma, todos os resultados de diferentes laboratórios podem ser comparados entre si. Isso é útil porque, com PCR em geral, há muitas variações. Quanto mais baixa for a expressão BCR-ABL1 , maior será a variação relativa. ”

No entanto, de acordo com os dois drs. Radich e Deininger, os médicos podem não aderir às diretrizes de teste RT-qPCR BCR-ABL1 por vários motivos. Em primeiro lugar, uma vez que os TKIs são eficazes, a CML é freqüentemente percebida como uma forma relativamente indolente de câncer que não representa um risco imediato para a vida do paciente. Em segundo lugar, “a CML não é tão comum em comparação com outros tipos de tumor”, disse o Dr. Deininger. “Muitas clínicas de oncologia menores atendem apenas alguns pacientes com LMC e podem não estar familiarizadas com as diretrizes”.

Dr. Radich também questionou se a frequência sugerida de monitoramento é ideal. “Começamos a fazer o monitoramento de PCR a cada 3 meses nos ensaios clínicos de TKI porque é assim que tínhamos feito anteriormente no contexto do transplante alogênico”, disse ele. “Essa prática tornou-se estabelecida em todos os ensaios clínicos e, na prática clínica, meio que travou.”

Ele sugeriu que, “se um paciente tiver uma resposta profunda, podemos diminuir a frequência de cada 3 meses para um monitoramento menos frequente após alguns anos. Na prática, os pacientes não são monitorados tão de perto [como nos ensaios clínicos] e o monitoramento menos frequente não parece ter um grande efeito em seus resultados ”.

The Rise of Resistance

Embora as diminuições no resultado q-RT-PCR BCR-ABL1 de um paciente sinalizem uma resposta ao tratamento, a falta de redução dos níveis de transcrição em pelo menos 1-log (10%) 3 meses ou mais após a terapia pode sinalizar um resultado subótimo. Além disso, a perda de uma resposta alcançada anteriormente é preocupante. “Se a doença de um paciente estava demonstrando uma resposta, mas então seus números de transcrição BCR-ABL1 começam a subir, isso significa que ele não está tomando o medicamento conforme prescrito ou seu médico deve estar procurando por uma mutação de resistência potencial e trocando-o por um diferente TKI ”, disse o Dr. Radich.

Se houver suspeita de resistência, os médicos precisam identificar uma nova mutação de resistência rapidamente, para que o paciente possa mudar para uma terapia diferente de TKI que possa inibir a proteína ABL que abriga a mutação - potencialmente frustrando o clone resistente emergente. O sequenciamento de próxima geração é normalmente realizado para identificar a presença de uma mutação no ABL.

Mudanças para vir?

Para o Dr. Radich, é possível que um teste RT-qPCR seja muito sensível. “As técnicas de PCR estão ficando mais sensíveis e, embora mais sensíveis soem melhor, em algum ponto, começaremos a detectar casos de doenças residuais mínimas que nunca teriam recidiva”, disse ele. “Então, a questão é: 'Até que profundidade precisamos ir?'”

Outra questão no horizonte é se os pesquisadores podem usar o monitoramento molecular baseado em PCR para identificar os pacientes que alcançaram uma resposta profunda de longo prazo e poderiam interromper seus TKI, sem aumentar o risco de recaída.

Finalmente, os pesquisadores começaram a estudar se os pacientes podem assumir a responsabilidade por seus próprios resultados, disse o Dr. Deininger ao ASH Clinical News. Ele citou um estudo em andamento na Europa no qual pacientes com CML têm acesso aos resultados de RT-qPCR. “Isso está surgindo como uma forma útil de melhorar a conformidade de nossos pacientes”, disse ele. “Eles têm que tomar o destino em suas próprias mãos.” - Por Anna Azvolinsky

Referências

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