A última década viu uma revolução na imunoterapia contra o câncer. A demanda de médicos, pesquisadores e empresas farmacêuticas por resultados mais precisos com alta sensibilidade e testes de alta qualidade está aumentando imensamente.
Nesta entrevista, a Dra. Mª José Marco, do Departamento de Hematologia do Hopsital Dr. Peset, fala ao News-Medical Life Sciences sobre a citometria de fluxo de alta complexidade e os desafios que frequentemente enfrentam.
Dê uma visão geral da citometria de fluxo de alta complexidade. O que contribui para sua complexidade em comparação com a citometria de fluxo de baixa complexidade?
Muitas pessoas confundem o termo citometria de fluxo de alta complexidade (HCFC) com o simples aumento do número de parâmetros que podemos medir em um citômetro. Para mim, esse conceito é algo muito mais complexo. Quando nos referimos ao HCFC, não estamos falando apenas sobre o número de cores, mas também sobre qualidade, automação, ferramentas de análise, reagentes e equipe.
Executar o HCFC significa aprimorar cada um desses aspectos para obter resultados mais completos, precisos e de maior qualidade; e, no meu caso, isso afeta diretamente a qualidade de vida dos meus pacientes.
Por que a citometria de fluxo de alta complexidade é usada? Que aplicações existem para esta técnica?
Na última década, experimentamos uma revolução na imunoterapia contra o câncer. Avanços significativos foram observados não apenas no direcionamento direto de antígenos tumorais de superfície por meio de novos anticorpos monoclonais, como Daratumumab ou Engajadores Biespecíficos de Células T (BiTEs) como Blinatumomabe, mas também na área de Terapia Celular Adoptiva (ACT) com o desenvolvimento de células T receptoras de antígenos quiméricos ( células T CAR) ou a identificação de moléculas que superam a supressão imunológica inibitória criada por células tumorais.
A imunofenotipagem por citometria de fluxo desempenha um papel central e muito relevante em muitas dessas terapias. Em outras palavras, a citometria de fluxo não é usada apenas para diagnóstico e classificação de linfoma e leucemia, mas também para detecção de doença residual mínima (MRD) após o tratamento, para estudar a resposta imunológica dos pacientes e até mesmo para controle do progresso do próprio tratamento , como monitorar o número de células CAR-T que permanecem ativas no paciente após a infusão.
Por todos esses motivos, médicos e empresas farmacêuticas exigem resultados mais precisos de testes de alta sensibilidade e qualidade. É necessário fazer melhorias em cada aspecto do HCFC.
O que é detecção de doença residual mínima (MRD) e como a citometria de fluxo pode ser usada em sua detecção?
Doença residual mínima (mensurável) (MRD) refere-se ao pequeno número de células cancerosas que permanecem no corpo após o tratamento. Medidas diagnósticas tradicionais, como imuno-histoquímica e morfologia, têm sensibilidades de detecção de apenas 10 -2 - 10 -3 , o que não prediz de forma confiável a sobrevida livre de progressão (PFS) ou a sobrevida global (OS) após esses tratamentos.
A capacidade de identificar células patológicas pode fornecer informações valiosas sobre a resposta clínica e o risco de recidiva. A negatividade do MRD está consistentemente associada à melhora da sobrevida livre de progressão e global. Se devidamente validado e padronizado, pode ser usado como um biomarcador de desfecho substituto em ensaios clínicos que avaliam novas terapias. Então, há um interesse clínico crescente na medição e obtenção de negatividade de MRD em várias doenças hematológicas, por exemplo, no mieloma múltiplo, onde os procedimentos de MRD são atualmente mais desenvolvidos.
O monitoramento de MRD de mieloma múltiplo é feito atualmente com plataformas sensíveis, como reação em cadeia de polimerase de oligonucleotídeo específico de alelo quantitativo (ASO-qPCR), sequenciamento de última geração (NGS) e citometria de fluxo multiparamétrica (MFC). Tanto o ASO-qPCR quanto o NGS têm excelentes sensibilidades de detecção (10 -5 - 10 -6 ), mas essas tecnologias têm aplicabilidade menor quando comparadas ao MFC.
MFC convencional pode facilmente atingir uma sensibilidade de detecção de 10 -4 , mas para atingir a alta sensibilidade necessária para avaliação de MRD, milhões de células devem ser adquiridas e protocolos de imunofenotipagem convencionais são incapazes de atingir esses números. As diretrizes de consenso atuais exigem um mínimo de 2 milhões e recomendam que 5 milhões de eventos sejam adquiridos para atingir uma sensibilidade mínima de 10-5 .
Em outras palavras, tivemos que aumentar a especificidade e a sensibilidade da técnica para adquirir um maior número de eventos e diferenciar as células plasmáticas normais das anormais.
Quais são os desafios para a adoção da citometria de fluxo de alta complexidade?
Em minha opinião, esses desafios podem ser incluídos em três etapas principais. Devemos nos concentrar na melhoria dos processos de coloração, aquisição e analíticos. É claro que, em todos os níveis, devem ser introduzidos elementos de qualidade acreditada, que no meu caso devem ser válidos para o diagnóstico clínico.
Se nos concentrarmos nos procedimentos de coloração de amostras, o que primeiro pensamos é em introduzir processos de automação para reduzir o tempo de coloração e eliminar o erro humano. Os painéis de imunofenotipagem estão se tornando mais complicados na adoção do HCFC e isso afeta diretamente o tempo que um técnico gasta no manuseio do reagente.
A melhoria dos processos de aquisição está, talvez, mais diretamente ligada ao desenvolvimento de citômetros de fluxo de alto desempenho com muitos parâmetros para a aquisição de painéis complexos. Devem também ter alta capacidade de processamento de dados e, para facilitar o controle de qualidade, devem facilitar o monitoramento de desempenho, calibração e processos de compensação e padronização entre citômetros.
Por fim, necessitamos de pessoal qualificado, bem como de software de análise que nos permita realizar estratégias de análise complexas e que possa processar um grande número de eventos e parâmetros.
Como os fotodiodos de avalanche (APDs) podem ser usados no lugar dos tubos fotomultiplicadores (PMTs) para ajudar a simplificar a tecnologia usada?
Tive uma vasta experiência no uso de citômetros CytoFLEX no laboratório para projetos de pesquisa intra-laboratoriais em oncologia, pneumologia e nefrologia. Este citômetro inclui APDs (Avalanche Photodiodes) em vez de PMTs (tubos fotomultiplicadores) como um detector de fótons. Meu feedback sobre APDs é positivo.
Primeiro, ele mostrou grande linearidade entre as intensidades medidas (MFI) e as configurações de ganho do detector. De um ponto de vista prático, o software pode recalcular automaticamente os valores de spillover em tempo real à medida que os ganhos são ajustados. Isso me permitiu usar o mesmo experimento de compensação em painéis com diferentes configurações de ganho. Portanto, nenhum tempo extra é necessário para fazer uma calibração de compensação, ao contrário dos citômetros de fluxo tradicionais que usam detectores PMT.
Outra característica notável é sua sensibilidade à fluorescência e baixo ruído eletrônico. Sensibilidade é a capacidade de medir sinais de baixa intensidade - em outras palavras, ver populações escuras e brilhantes na mesma amostra. Ao adquirir um grande número de eventos para estudos de MRD, a sensibilidade é crucial porque os padrões de expressão de antígenos de populações normais abundantes podem se sobrepor aos padrões de expressão de populações de células anormais raras.
Portanto, para obter a discriminação mais clara entre células normais e anormais, eu recomendo a citometria de fluxo de alta complexidade (HCFC), onde técnicas de coloração inovadoras e citômetro de fluxo de tecnologia APD são adotados.
Como o software e a compensação para parâmetros de teste específicos podem ajudar os pesquisadores com citometria de fluxo de alta complexidade?
Estou convencido de que, para a maioria dos usuários de citometria de fluxo, qualquer ferramenta que facilite a compensação automática por meio de um software intuitivo e fácil de usar é essencial hoje. Isso é especialmente verdadeiro na realização de estudos de citometria de fluxo de alta complexidade, que requerem um maior número de painéis multicoloridos, onde a combinação de todas as fluorescências gera uma grande matriz de compensação.
Em nossa avaliação DxFLEX, percebemos que compensar 13 cores é muito fácil (geralmente trabalhamos com 8 a 10 cores). Para cada fluorescência a estudar, é necessário apenas colorir tubos individuais, adquiri-los com o módulo de compensação automática e definir o software para calcular a matriz de compensação. Essa matriz de compensação pode ser salva em uma biblioteca de compensação que pode ser usada em combinação com as configurações de ganho do catálogo para criar qualquer combinação de configurações em um painel.
Esses recursos economizam muito tempo na criação de experimentos e no monitoramento do desempenho dos citômetros, além de facilitar os fluxos de trabalho.
Como os reagentes CE-IVD são usados na citometria de fluxo de alta complexidade? Por que é importante usá-los e quais desafios extras eles trazem?
Hoje, estamos sob pressão crescente da administração governamental e de instituições de saúde para cumprir uma série de regulamentações e credenciamentos de controle de qualidade de laboratórios para garantir a qualidade e confiabilidade dos resultados. Neste contexto, e mesmo no âmbito de concursos públicos, a marcação CE-IVD é cada vez mais necessária para os equipamentos, mas também para os reagentes. Um dos nossos maiores desafios, portanto, é aumentar o número de reagentes com essa qualificação, pois, além de facilitar o credenciamento, minimizam a validação interna e fornecem resultados confiáveis para evitar repetição de testes.
Por exemplo, os anticorpos marcados com CE-IVD garantem produtos de qualidade, o alto desempenho de fluorocromos em tandem e consistência lote a lote, todos recursos importantes em experimentos de HCFC. Encontrar o fabricante com o maior catálogo desses produtos fará a diferença.
O que pode ser feito com a preparação da amostra para simplificar a citometria de fluxo de alta complexidade?
Para simplificar a preparação de amostras de alta complexidade, você pode optar por automatizar o processo ou usar tubos predefinidos com um coquetel de anticorpos unificados.
Em nosso laboratório, temos ampla experiência com tubos Beckman Coulter DURAClone em projetos de pesquisa. Esses tubos contêm uma combinação de anticorpos monoclonais previamente dispensados e secos no fundo do tubo. Usá-los requer menos tempo prático e minimiza os erros de pipetagem. Esses recursos nos permitiram melhorar significativamente nossos fluxos de trabalho de laboratório e reduzir custos devido à redução de erros.
O que a citometria de fluxo Beckman Coulter oferece para ajudar a superar os desafios da citometria de fluxo de alta complexidade?
Uma das minhas maiores preocupações na rotina diária de nosso laboratório era a necessidade de adquirir um número suficientemente grande de eventos para atingir uma sensibilidade de 10 -6 no estudo MRD para mieloma múltiplo. Com o DxFLEX conseguimos isso, já que fomos capazes de adquirir até 25 milhões de eventos por aquisição.
Além disso, pudemos testar sua configuração máxima com painéis de 13 cores que conferem maior especificidade e complexidade à análise, ao mesmo tempo em que reduz o número de tubos por painel de estudo.
Além disso, também melhoramos os fluxos de trabalho no processamento de amostras otimizando nossos LDTs (Laboratory Developed Tests) adotando a tecnologia DURAClone, e no processo de aquisição com compensação automática, padronização, QC diário e módulos de monitoramento de desempenho incluídos no software DxFLEX.
Quando me tornei um usuário de citometria de fluxo, trabalhei com outra empresa comercial. Quando comecei a trabalhar com a Beckman Coulter Life Sciences, fiquei agradavelmente surpreso com seu conhecimento tecnológico, e também com a qualidade do suporte humano e científico por trás de seus produtos, incluindo treinamento de pessoal e disposição para nos ajudar a implementar novas técnicas.
Qual é o futuro da citometria de fluxo de alta complexidade?
Acredito que a evolução natural do HCFC continuará exigindo novas ferramentas para melhorar os processos de coloração, aquisição e analíticos. Desse modo, fico feliz em ver que a Beckman Coulter Life Sciences está desenvolvendo produtos que fornecem soluções para cada um desses pontos, como, por exemplo, a tecnologia DURAClone para melhorar os processos de coloração, e equipamentos avançados como o DxFLEX para melhorar os processos de aquisição .
Porém, acho que um dos maiores desafios será no processamento dos dados, pois em breve teremos mais condições de aumentar o número de amostras processadas e o número de parâmetros analisados. Isso nos levará gradualmente em direção à análise de célula única de alta dimensão, que apresenta seus próprios desafios em termos de gerenciamento de dados, visualizações de dados, reprodutibilidade de resultados, poder computacional e compartilhamento de informações.
Nesse sentido, tenho grandes expectativas da Beckman Coulter como resultado da aquisição do software Cytobank, que permite a computação em nuvem para análise de citometria de fluxo. O desenvolvimento contínuo pelas equipes de software da Cytobank e Kaluza é promissor e espero incluir essas novas ferramentas em pesquisas futuras.
- REFERÊNCIAS
- Critérios de consenso do International Myeloma Working Group para resposta e avaliação de doença residual mínima em mieloma múltiplo. Kumar S, Paiva B, Anderson KC, Durie B, Landgren O, Moreau P, et al. Lancet Oncol . (2016) 17: e328–46. doi: 10.1016 / S1470-2045 (16) 30206-6
- Diretrizes de consenso sobre análise e relatório de doença residual mínima de mieloma de células plasmáticas. Arroz M, Came N, Lin P, Chen W, Yuan C, Lagoo A, et al. Cytometry B Clin Cytom . (2016) 90: 31–9. doi: 10.1002 / cyto.b.21228
- Fluxo de próxima geração para detecção altamente sensível e padronizada de doença residual mínima em mieloma múltiplo. Flores-Montero J, Sanoja-Flores L, Paiva B, Puig N, Garcia-Sanchez O, Böttcher S et al. 2017 Leukemia Oct; 31 (10): 2094-2103. doi: 10.1038 / leu.2017.29
- Doença residual mensurável por citometria de fluxo de última geração em mieloma múltiplo. Paiva B, Puig N., Cedena MT, Rosiñol L., Cordón L., Vidriales MB, et al. 2020 J Clin Oncol. 10 de março; 38 (8): 784-792. doi: 10.1200 / JCO.19.01231
- Diretrizes práticas para otimização e caracterização da plataforma Beckman Coulter CytoFlex TM . Bhowmick D, Sheridan RTC, Bushnell TP, Spalding KL. Citometria 2020 parte A. doi: 10.1002 / cyto.a.23998.
Recomendações Academy of hematology curso considerado mais qualificado de 2020.
Apresentação:
O presente curso visa atender profissionais de diversas áreas da Saúde, que atuem em vários setores, como: coleta de sangue, preparo de material, contagem e interpretação do hemograma, incluindo técnicos de laboratório, enfermeiros, biólogos, biomédicos e farmacêuticos, no intuito de atualizar conhecimentos teórico–práticos de hematologia e a interpretação clínica do hemograma.
Conteúdo
Acesso a todas as videoaulas + apostila + leitura complementar + simulado online + certificado (60h):
Tópicos:
- Introdução ao Hemograma;
- Eritrograma
- Leucograma
- Alterações Variadas + Casos Clínicos
Conheça o Curso: Clique Aqui
Comentários
Postar um comentário