As hemácias são células anucleadas, o tipo de célula mais abundante do corpo, estando presentes em todos os tecidos, com vida útil de 120 dias. Eles também não têm moléculas do complexo principal de histocompatibilidade de classe I e, portanto, eritrócitos tipo O negativos podem ser usados por todos os pacientes. Isso os torna automaticamente ideais como veículos de entrega para moléculas terapêuticas, para uma variedade de condições, incluindo a pandemia de doença coronavírus em curso 2019 (COVID-19).
Em um novo estudo, lançado no servidor de pré-impressão bioRxiv *, uma equipe de pesquisadores explora o potencial antiviral dos glóbulos vermelhos contra o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), o patógeno causador do COVID-19.
Atingindo altos níveis de receptores de HIV-1
RBCs manipulados podem ser usados para criar armadilhas virais, que atraem os vírus para se ligarem a eles e infectá-los. Isso é conseguido permitindo-lhes apresentar receptores virais em sua superfície. Os vírus que infectam os eritrócitos não podem se replicar devido à falta de ácido nucléico , que protege as células-alvo reais da infecção.
Para expressar uma proteína, a célula deve ter maquinaria de tradução, que está ausente nos eritrócitos maduros. Para fazer isso, as células progenitoras eritroides precisam ser projetadas antes de se diferenciarem. Durante o processo de maturação, a expressão do transgene é tipicamente evitada pelo silenciamento da transcrição, mecanismos que controlam a síntese de proteínas a partir de genes transcritos e a quebra de proteínas que normalmente não são encontradas nos eritrócitos.
Expressão do transgene
Para conseguir isso, os pesquisadores combinaram um sistema de expressão transgênica junto com a otimização do códon do transgene, para permitir que os RBCs expressem os receptores CD4 e CCR5 do HIV-1 em níveis elevados. Isso transformou os eritrócitos enucleados em armadilhas virais que são inibidores poderosos da infecção pelo HIV-1.
Os pesquisadores primeiro aplicaram um protocolo in vitro para diferenciar células-tronco hematopoiéticas (HSCs) CD34 + humanas em reticulócitos (eritrócitos imaturos que ainda contêm RNA ribossômico e, portanto, ainda podem realizar a tradução de proteínas, mas não possuem núcleos). A proliferação de HSC foi seguida pela inserção dos genes CD4 ou CCR5 'estranhos' nas células progenitoras eritróides por vetores lentivirais.
Além disso, os pesquisadores inseriram um gene para expressar uma proteína de fusão CD4-glicoforina A (CD4-GpA). Esta proteína é composta de domínios extracelulares CD4 D1D2 fundidos à extremidade N-terminal da proteína RBC comum, GpA. Isso era para permitir que anticorpos de domínio único fossem expressos em RBCs. CD4 é uma proteína transmembrana de passagem única e CCR5 é uma proteína transmembrana de passagem múltipla. Este protocolo é adequado apenas para CD4, e não para CCR5
Eles descobriram que o uso do promotor CMV ou promotores ubíquos levou a uma baixa expressão do transgene. Eles, portanto, mudaram para o uso de um promotor específico para eritroides usando o lentivírus CCL-βAS3-FB. Este vetor contém elementos que regulam positivamente a expressão de beta-globina durante o desenvolvimento de RBCs. Esses elementos do vetor incluem β-CD4, β-CD4-GpA e β-CCR5.
O resultado foi um grande aumento na expressão de CD4, um realce menor de CCR5 e nenhuma alteração em CD4-GpA. A razão atribuída a isso foi o pequeno número de RNAs ribossômicos e de transferência dentro dos RNAs, o que limitou a expressão dos transgenes nas hemácias em diferenciação.
Otimização de códon
Para resolver isso, eles otimizaram os códons do transgene, garantindo que gerassem sequências de cDNA que aumentavam a expressão de todos os transgenes.
Essas células modificadas sofreram diferenciação eficiente em eritrócitos enucleados, quase todos expressando GpA, enquanto um em cada três expressou níveis elevados de CD4 e CCR5 semelhantes aos das células T CD4 +. Cerca de 6% dos RBCs CD4-CCR5 foram infectados com o vírus HIV-1 de teste, em comparação com 0,3% ou menos dos RBCs de controle ou RBCs CD4 +. No geral, portanto, isso equivale a cerca de um quinto de todos os CD4-CCR5-RBCs.
Com CD4-CXCR4-RBCs, foram observadas taxas de infecção mais altas. As taxas de infecção foram baixas com células CD4-GpA-CCR5 ou CD4-GpA-CXCR4. Isso persistiu mesmo com a adição dos domínios CD4 D3D4. A razão para essas baixas frequências de infecção pode ser a incapacidade do CD4-GpA de co-localizar com os co-receptores CCR5 e CXCR4, uma vez que o GpA não pode se localizar em subdomínios lipídicos, ao contrário do CD4.
RBCs projetados neutralizaram o HIV-1 de forma potente
O potencial de captura viral foi avaliado por um ensaio de neutralização do HIV-1. Isso mostrou que é possível atingir concentrações terapêuticas in vivo , porque a metade da concentração inibitória máxima (IC50) para pseudovírus do HIV-1 foi de 1,7x10 6 eritrócitos / mL, que é cerca de 0,03% da concentração de hemácias no sangue humano. O nível mais alto de expressão de CD4-GpA aumentou a atividade de neutralização em quatro vezes.
A atividade de neutralização mais baixa ocorreu quando o CCR5 foi co-expresso com RBCs CD4 ou CD4-GpA, em 2-3 vezes, talvez porque CCR5 cause uma pequena queda no nível de expressão de CD4-GpA e CD4. No entanto, estudos in vivo serão necessários para demonstrar o potencial de benefício com a co-expressão de CCR5 em armadilhas virais de RBC.
Seu trabalho em nanopartículas semelhantes a vírus apresentando agrupamentos de CD4 (CD4-VLPs) mostrou que a capacidade dessas partículas de interagir com os trímeros da proteína do envelope do HIV-1 lhes permitiu neutralizar uma variedade de cepas de HIV-1, ao mesmo tempo que bloqueou o escape viral na Vivo. Curiosamente, essas interações aumentam a potência dos CD4-VLPs em mais de 10.000 vezes em comparação com os inibidores de CD4 e CD4-Ig solúveis. O estudo atual mostra que o mesmo nível de eficácia pode ser esperado com o uso de armadilhas virais de RBC e CD4-VLPs por meio de interações de alta avidez com antígenos Env do HIV-1 .
Geração constante de armadilhas virais de RBC
Essa estratégia foi então usada para produzir linhagens progenitoras eritroides que continuam a gerar armadilhas virais potentes de RBC contra HIV-1 e SARS-CoV-2. Para se certificar de que essas armadilhas virais seriam produzidas continuamente, os pesquisadores modificaram uma linha celular eritroblástica imortalizada (BEL-A) para expressar CD4-GpA em níveis estáveis elevados. Eles descobriram que sofreram diferenciação eficiente em eritrócitos enucleados em mais da metade das células, enquanto continuavam a expressar o antígeno modificado. Essas células neutralizaram poderosamente a infecção pelo HIV-1 com um IC50 de 2,1x10 7 RBCs / mL.
O SARS-CoV-2 utiliza a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) da célula hospedeira como seu receptor de entrada. O domínio extracelular de ACE2 foi fundido a GpA para criar uma proteína quimérica e a linha celular BEL-165 A foi projetada para expressar esta proteína. Quando este foi exposta para a SARS-CoV-2 à base de lentivírus pseudovírus , os investigadores descobriram que o vírus foi altamente neutralizado, com uma IC50 de 7x10 5 RBC / ml.
Estes resultados sugerem que as linhas de células que são usadas para produzir tais armadilhas virais de RBCs, expressando um receptor de hospedeiro definido, podem ser geradas rapidamente. “As armadilhas virais para RBC têm o potencial de se tornarem poderosos agentes antivirais contra uma variedade de vírus.” Eles podem persistir no corpo por 120 dias, garantindo o controle contínuo da infecção pelo HIV-1.
- Hoffman, MAG et al. (2020). Caracterização in vitro de células vermelhas do sangue manipuladas como armadilhas virais potentes contra HIV-1 e SARS-CoV-2. pré-impressão bioRxiv . doi: https://doi.org/10.1101/2020.12.20.423607 . https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.12.20.423607v1
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