Uma equipe chefiada por Hideharu Mikami da Universidade de Tóquio determinou recentemente um método de imagem baseado em optomecânica que supera o desempenho e a utilidade da citometria de fluxo de imagem (IFC).
O método permite imagens de alto rendimento de células individuais viajando a> 10.000 células seg -1 sem comprometer a sensibilidade ou resolução e permitindo uma análise estatística robusta e classificação precisa de células.
O IFC tradicional oferece várias vantagens sobre a citometria de fluxo tradicional, fornecendo dados de imagem quantitativos. Esses dados permitem a caracterização de células únicas em populações heterogêneas. O big data resultante da metodologia IFC é relevante em um momento em que o aprendizado profundo é necessário para melhorar a tomada de decisão clínica nos ambientes biomédico e clínico.
As limitações da citometria de fluxo de imagem tradicional
A IFC é particularmente eficaz para a enumeração de uma gama de macromoléculas, incluindo proteínas, ácidos nucléicos, a análise da interação célula-célula e a caracterização de danos e reparo de DNA. No entanto, o desempenho e a utilidade do IFC sofrem como resultado das tentativas de aumentar o rendimento, a resolução espacial e a sensibilidade.
Ao aumentar a velocidade do fluxo para alto rendimento, resulta em um período de integração mais curto, permitindo a coleta de imagens sem desfoque; no entanto, o efeito é a sensibilidade reduzida ou resolução de pixels para combater isso.
Para superar isso, o atraso de tempo e integração (TDI) com um sensor de imagem baseado em um dispositivo acoplado carregado (CCD) foi usado. O TDI acumula várias exposições de células em fluxo, com várias fileiras de elementos fotossensíveis CCD. No entanto, isso limita o rendimento à medida que a taxa de leitura do CCD diminui.
Um problema adicional sofrido pelo CCD é o ruído de leitura, que limita sua sensibilidade de detecção. Algumas tentativas de superar a desvantagem são imagens de pixel único e uso de um sensor de imagem semicondutor de óxido metálico complementar (CMOS) - mas estes, por sua vez, limitam a sensibilidade.
O traço unificador dessas técnicas compensatórias é o compromisso de um dos parâmetros-chave em favor de outros. Isso evita a aplicação do IFC em aplicações de nicho, o que motiva o estudo da equipe da Universidade de Tóquio.
Um novo método de imagem optomecânico
Mikami et al . referem-se ao seu método de imagem aprimorado como imagem de fluorescência de congelamento virtual (VIFFI). Crucialmente, as compensações são contornadas, enquanto o alto rendimento (> 10.000 células seg -1 ), a resolução espacial de aproximadamente 700nm e a alta sensibilidade são garantidas.
O método é baseado no congelamento de uma célula em fluxo no sensor de imagem, cancelando o movimento de uma única célula para aumentar o tempo de exposição do sensor de imagem. Isso produz uma imagem de fluorescência com uma alta relação sinal-ruído (SNR).
Os elementos essenciais da citometria de fluxo VIFFI é um scanner de feixe de excitação que varre o campo de visão (FOV) e o tempo simultâneo da exposição dos sentidos da imagem e da iluminação dos feixes de excitação. Em combinação, o congelamento virtual se traduz em 1000 vezes mais vezes para a integração do sinal no sensor de imagem. Isso resulta em imagens de fluorescência de microscopia de células em 1 ms -1.
A metodologia por trás da técnica do grupo envolveu o design óptico do citômetro de fluxo VIFI, a realização de uma varredura de feixe de excitação para estender o tempo de exposição para as células de fluxo rápido, aquisição de dados e o processamento das imagens digitais e aprendizado profundo.
Aplicação de imagem de fluorescência de congelamento virtual
O grupo usou duas cores. A equipe apontou que várias cores podem ser usadas para imagens de fluorescência quando divisores de feixe dicróicos são usados. O grupo também comentou sobre a compatibilidade da citometria de fluxo VIFFI com a técnica avançada de microscopia de fluorescência baseada em sensor de imagem - permitindo fluorescência de super-resolução.
Além disso, a técnica permite que a velocidade do fluxo seja variada, desde que esteja em conformidade com a relação de compensação entre o FOV, o tempo de exposição e a velocidade do fluxo. Junto com esse avanço, o aprendizado de máquina permitirá que a profundidade da análise de dados alcançada seja expandida. Da mesma forma, conforme os avanços na tecnologia do sensor de imagem são alcançados, espera-se que o alto rendimento e o número de opções de cores de fluorescência sejam aumentados. O VIFFI também permite que a profundidade de campo seja expandida. Isso é útil para imagens FSIH e imagens de células grandes.
Devido à resolução espacial de sensibilidade em alto rendimento dessa imagem de fluorescência, as aplicações em biologia, farmácia e medicina são expandidas. Em primeiro lugar, a análise de FISH de alto rendimento é capaz; esta técnica é especialmente útil no diagnóstico, identificação e detecção de doença residual mínima. A microscopia tradicional é insuficiente, pois a triagem de grandes populações de células não é possível.
Como prova de conceito, a equipe demonstrou análises em larga escala com base no fenótipo morfológico. Isso sugere que esta técnica é inestimável para determinar a relação genótipo-fenótipo. Especificamente, a alta resolução espacial permite a caracterização precisa dos principais recursos, como área e perímetro de cada célula e organelas intracelulares.
O grupo também ilustrado por meio de imagens de mutantes de C. reinhardtii, a citometria de fluxo VIFF I pode ser usada para avaliar a mutagênese.
Finalmente, a citometria de fluxo VIFFI pode detectar e contar células tumorais circulantes (CTCs) de amostras de sangue heterogêneas. CTCs e clusters únicos podem ser visualizados e contados; espera-se que isso ajude o estudo da correlação entre o tamanho do agrupamento e o potencial metastático / disseminação de CTCS.
Fonte
- Mikami, H. et al (2020) Virtual-freezing fluorescence imaging flow cytometry. Nature Communications. DOI: 10.1038 / s41467-020-14929-2.
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